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La inseminación artificial implica el almacenamiento y el transporte de dosis de semen en tubos de termosellar, donde los espermatozoides están en contacto directo con los plásticos. Estudios recientes han demostrado que algunos componentes químicos que se transfieren desde los plásticos al semen causan fallo reproductivo y retornos a celo.

Cristina Nerín [1]*, Pilar Alfaro [1], Margarita Aznar [1], María Victoria Falceto [2], Olga Mitjana [2] y Cristina Bonastre [2]
1. I3A, Universidad de Zaragoza, Campus Río Ebro, María de Luna 3, 50018 Zaragoza
2. Departamento de Patología Animal, Facultad de Veterinaria de Zaragoza
*Email: cnerin@unizar.es
Imágenes cedidas por las autoras

Desde hace dos décadas las dosis de semen destinadas a la producción porcina se pre­paran y se distribuyen a las granjas en envases plásticos (botes, tubos o blíster). Además, los fallos reproducti­vos (tasa de fertilidad y prolificidad) nun­ca se habían relacionado con el envase sino con otras causas: instalaciones, fac­tores ambientales y de granja, calidad de semen, el agua y los piensos, etc.

El reciente descubrimiento de que los fa­llos reproductivos unidos al semen son provocados por la migración de com­puestos desde el envase plástico hacia la dosis seminal (Nerín et al., 2014) ha puesto en alerta al sector de producción animal. La falta de control de la compo­sición de los envases de plástico, ya sean blíster o tubos de termosellar, para su uso en contacto con el semen, así como el desconocimiento generalizado de la influencia que pueden tener los plásticos sobre cualquier producto en contacto con ellos, ha ocasionado serios episodios de problemas de desarrollo embrionario o de falta de capacidad fecundante del semen a nivel internacional.

Composición de los plásticos

Todos los materiales poliméricos gene­ralmente llamados “plásticos” contie­nen aditivos, que son necesarios para proporcionarles las propiedades que su uso requiere. Entre ellos se pueden citar antioxidantes, plastificantes, agentes de deslizamiento, colorantes, absorbedo­res UV, estabilizantes, etc. Además de los aditivos propios del polímero, hay que considerar también los compuestos residuales procedentes de la reacción de polimerización.

Por otra parte, la necesidad de conser­vación frente al deterioro natural y la protección frente a la oxidación del pro­ducto pueden llevar consigo el empleo de materiales multicapa, en los que se com­binan distintos materiales para conse­guir menor permeabilidad al oxígeno, al CO₂, al vapor de agua, etc. La mayoría de estos materiales multicapa se obtienen uniendo con adhesivo capas de diferen­tes polímeros.

Finalmente, cuando se obtiene el mate­rial final, se aplican tintas de impresión con el código de barras o bien etiquetas autoadhesivas, que añadirán de nuevo, además de las tintas, otros adhesivos, etc. que pueden afectar a la capacidad reproductiva de los espermatozoides.

Si bien la matriz polimérica que da lugar al nombre principal del plástico (polieti­leno, polipropileno, poliamida, etc.) está constituida por moléculas muy grandes que no pueden transferirse al producto en contacto con el plástico, los aditivos y otros compuestos residuales proceden­tes de los plásticos, adhesivos y tintas son moléculas relativamente pequeñas. Se sabe que todas las moléculas con tama­ño molecular inferior a 1.000 unidades de masa atómica (uma) difunden a través de los plásticos y se transfieren al produc­to en contacto con ellos. Este fenómeno, llamado migración, ocurre siempre en mayor o menor medida. La extensión en la que se produce la migración depende de las características de cada molécula, de su concentración en el plástico, de las condiciones de tiempo y temperatura de contacto entre el plástico y el producto final y de la polaridad y características del producto, ya sea sólido o líquido. Mediante este fenómeno de migración, el semen en contacto con el plástico puede verse contaminado por algunos de los compuestos procedentes del envase. Di­cha contaminación puede ocasionar fal­ta de fertilidad del semen y alteraciones en el desarrollo embrionario. Por ello, es de extrema importancia controlar cuida­dosamente los plásticos que se emplean como recipientes para dosis seminales en inseminación artificial.

En los últimos años, el laboratorio del I3A en el Centro Politécnico Superior de Ingenieros (ahora Escuela de Ingeniería y Arquitectura) de la Universidad de Zara­goza ha estudiado a fondo muchos de los plásticos comerciales que se emplean en este sector, tanto blíster como tubos de termosellar de distintas procedencias. A continuación se muestran algunos de los resultados obtenidos.

Material y métodos

Se han estudiado blíster y tubos de dis­tintos proveedores relacionados con la reproducción porcina con un mínimo de cinco réplicas por envase.

El método inicial de control es el análisis de los blíster y tubos de termosellar. Para ello se realiza una extracción con disol­vente y se analiza el extracto por GC-MS (cromatografía de gases con detector de espectrometría de masas). Este método permite identificar los compuestos volá­tiles y semivolátiles presentes a partir de su espectro de masas, que es característi­co de cada sustancia.

Además el extracto se analiza también por UPLC-MS-Q-TOF (cromatografía líquida de ultra-alta resolución con de­tector de espectrometría de masas de cuadrupolo y tiempo de vuelo) para la identificación de los compuestos no vo­látiles.

Una vez identificados los compuestos se procede a confirmar su identidad, adqui­riendo para ello el mismo compuesto puro y analizándolo en las mismas condiciones. A partir del compuesto puro se prepara una recta de calibración, con objeto de cuantificar la concentración de cada com­puesto previamente identificado.

Con esta información se comprueba la toxicidad de cada compuesto y, si existe sospecha de toxicidad para la reproduc­ción, se realiza primero un ensayo de mi­gración a disolución acuosa, con el fin de confirmar si existe migración de dichos compuestos o no. Hay que resaltar que el primer control es el análisis del plásti­co, pero la sola presencia de compuestos en el plástico no implica necesariamente que haya migración en concentración su­ficiente como para afectar la capacidad reproductiva del semen. Obviamente, la presencia en el plástico de compuestos que ya se han demostrado que son tóxi­cos para la reproducción invalida dicho plástico para su uso en blíster y tubos para dosis seminales.

En el caso de que los compuestos identi­ficados migren y no se conozca su efecto frente al semen, se realizan ensayos de reprotoxicidad con la cantidad y la sus­tancia detectada, así como a diferentes concentraciones crecientes y decrecien­tes. Estos ensayos implican el estudio de parámetros de rutina como son la moti­lidad, test de endósmosis, test de resis­tencia osmótica, vitalidad y acrosomas íntegros, así como otros análisis más complejos como el test de penetración in vitro y diferentes pruebas de fluores­cencia.

Resultados y discusión

En las figuras 1 y 2 se muestran los cro­matogramas de un extracto de tubo y de un extracto de blíster, ambos con sustan­cias reprotóxicas identificadas.

Los cromatogramas de la parte superior e inferior de las figuras 1 y 2 respectiva­mente corresponden al blanco de proce­so, es decir, sin contacto con el plástico. Cada pico corresponde a un compuesto diferente.

Figura 1. Cromatogramas de un extracto de tubo de termosellar para envasado de dosis seminales.

Figura 2. Cromatogramas de un extracto de blíster para envasado de dosis seminales.

Como puede observarse a partir de es­tos datos, hay bastante variabilidad en cuanto a la aparición de compuestos, de manera que ninguno de los plásticos es­tudiados puede considerarse totalmente inerte. Hay que destacar que la mayoría de los compuestos encontrados no están intencionadamente añadidos a los polí­meros, sino que se trata de sustancias no intencionadamente añadidas, llamadas NIAS (Non Intentionally Added Subs­tances) resultantes de la descomposición del polímero y sus aditivos durante la producción y manufactura a altas tem­peraturas. También pueden derivar de la interacción entre ingredientes de tintas y adhesivos o de las reacciones colaterales que ocurren durante la producción de los mismos.

Sin embargo, afortunadamente la mayo­ría de los compuestos identificados no producen ninguna alteración en el semen y por tanto no alteran su capacidad repro­ductiva. Hay que resaltar además que la sola presencia de compuestos en el plásti­co no implica que todos sean tóxicos, sino que hay que investigar si dichos compues­tos migran, y si lo hacen, cuál es la con­centración resultante en la disolución de semen. Como ya se ha mencionado, hay que comprobar además si dichos com­puestos a esta concentración son tóxicos para la reproducción. La figura 3 muestra un ejemplo del estudio de reprotoxicidad realizado con alguna de las sustancias tó­xicas detectadas cuando estas se añaden al semen en concentraciones crecientes.

Figura 3. Test de penetración in vitro.

Hay que destacar además que la toxicidad reproductiva no se pone de manifiesto siempre de la misma forma; por ejemplo, la figura 3 muestra una tendencia clara de disminución de la tasa de penetración al aumentar la concentración de la sustan­cia, en el rango de ppb (μg/l), mientras que con otras sustancias este parámetro no se ve afectado.

Además de estos estudios in vitro a nivel individual de las sustancias que migran desde el plástico, hay que tener en cuen­ta que algunas de ellas actúan en sinergia con otras presentes en el medio, poten­ciando la toxicidad de las mismas (Nerín et al., 2014).

Hay que resaltar que el estudio de sus­tancias químicas potencialmente tóxicas procedentes de los materiales plásticos en contacto directo con los espermatozoi­des (células vivas) ha sido pionero en el mundo (Nerín et al., 2014), permitiendo demostrar las causas de la falta de capa­cidad reproductiva y explicar los fallos detectados en reproducción animal en multitud de granjas.

Conclusiones

Del estudio realizado queda claro que es extremadamente importante que se controlen cuidadosamente los materiales que se ponen en con­tacto con el semen, ya sean blíster o tubos de termosellar, puesto que to­dos ellos pueden ocasionar pérdidas económicas significativas a nivel de productividad en granja. La exten­sión en la que este daño se produzca dependerá de las sustancias especí­ficas que hayan migrado desde el en­vase y de la toxicidad de las mismas en contacto directo con el semen. Algunas de las sustancias encontra­das migran en concentraciones muy bajas, del orden de pocas ppb (μg/l), pero su contacto con el esperma es suficiente como para causar un daño irreparable.

Referencias

C. Nerin, P. Alfaro, M. Aznar, E. Canellas, J.L.Ubeda, Y. Dahmani, and R. Ausejo. 2014. Compounds from multila­yer plastic bags cause reproductive failures in artificial insemination. Nature (Scientific Reports) Sci. Rep. 4, 4913; DOI:10.1038/srep04913 – 2014 http://www.nature.com/srep/2014/140509/srep04913/full/srep04913.html